Electroforesis: ¿cuáles son los reactivos necesarios?

08/23/2021by Kalstein
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La electroforesis es una técnica analítica en la que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su relación tamaño a carga eléctrica, usándose como base una matriz gelatinosa.

¿Cuáles reactivos se emplean en la electroforesis?

La electroforesis se lleva a cabo con un equipo compuesto de una carga negativa en un extremo y una carga positiva en el otro, denominado sistema de electroforesis. En esta técnica se utilizan reactivos como:

  • Tampón de carga : Es una disolución que se mezcla con la muestra antes de aplicarla al gel. Sus componentes cumplen varios propósitos:

En electroforesis de DNA: El glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos. Azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol) como marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos. Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las moléculas.

En electroforesis de proteínas SDS-PAGE se denomina también tampón de ruptura (ya que provoca la desnaturalización): El glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos. Azul de bromofenol como marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos. SDS para provocar la desnaturalización de las proteínas (ayudado por un calentamiento breve a 90-100° C). β-mercaptoetanol para romper los enlaces disulfuro (una reacción de reducción, el disulfuro se convierte en dos tioles). Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las moléculas.

  • Agarosa DNA: Se trata de un polisacárido sintetizado por algunas algas, que forma parte del agar-agar (ingrediente de medios de cultivo). Para su uso en electroforesis se emplea un producto más purificado.
  • Poliacrilamida: La poliacrilamida es un polímero entrecruzado que forma geles porosos. Se realiza una polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida [ N,N’-metileno-bis(acrilamida) ].
  • Persulfato amónicoDNAproteínas: Aunque no es un componente del gel, se utiliza como reactivo en la formación de la poliacrilamida.
  • TEMED: La tetrametiletilenodiamina (TEMED) acelera la reacción de polimerización de la acrilamida, pues propaga la generación de radicales libres. Facilita la reacción por la que se forma el polímero de acrilamida.
  • Azul de Coomassie: El nombre completo es azul brillante de Coomassie R-250. Se trata de un compuesto coloreado que se une a todo tipo de proteí
  • Azul de bromofenol: Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores a 300 pb), es decir, marca el «frente de avance».
  • Xileno cianol: Se trata de compuestos coloreados y con carga, utilizados para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis el xileno-cianol se mueve aproximadamente como las moléculas de DNA de 3500 a 5000 pb.
  • Bromuro de etidio: Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-anaranjado.

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