¿Cómo se lleva a cabo la Reacción en Cadena de la Polimerasa?

08/10/2022by Kalstein
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La reacción en cadena de la polimerasa, es una reacción química, usada en los laboratorios de biología molecular, se usa para estudiar ciertos cambios en un gen o cromosoma, que aportan información para diagnosticar una afección genética, o una enfermedad, como el cáncer. También se usa para identificar trozos de ADN de determinadas bacterias, virus o microorganismos para establecer una infección. 

Para ello, se usa un Termociclador, como herramienta tecnológica innovadora, dirigida al estudio de los ácidos nucleicos. Se caracteriza por ser una técnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y eficiencia, que genera resultados confiables en poco tiempo y fáciles de analizar, a través de la multiplicación in Vitro de una secuencia de ADN, mediante procesos continuos de calentamiento y enfriamiento a muy alta velocidad (mayores a 1°C/seg), que así se podrá estudiar en mayor detalle.

Desarrollo de la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

Primeramente, la reacción en cadena de la polimerasa, es una resistencia enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN, durante varios períodos renovados en los que la secuencia blanco, es copiada. Para ello, la reacción se beneficia de la actividad de la enzima ADN polimerasa, que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células.

Para ello, cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: 

  • Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. Además, depende de la velocidad en la que el Termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo. Logrando las cadenas separadas, que se utilizarán como templado para el siguiente paso. 
  • Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo del templado previamente separado, e hibridan con su secuencia complementaria. Para ello, la temperatura de hibridación oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente. 
  • Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida. La extensión de las cadenas, es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura, la enzima es funcional. 

Finalmente, se habrán formado las ampliaciones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.

Análisis de los resultados del PCR

Para detectar la exitosa amplificación de la muestra, el análisis de la reacción es el paso final para determinar la cuantificación génica. Para ello, los Termocicladores, están suministrados de una PC con un software que generalmente son fáciles de usar. Este software, crea una serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para conocer si la reacción fue exitosa. 

De igual manera, otro paso importante del análisis, es elegir el tipo de cuantificación que se usará para determinar la amplificación precisa del blanco génico; este medio depende de los intereses del investigador. Para ello, existen dos tipos de cuantificación: la absoluta y la relativa. La primera, se utiliza para conocer el número exacto de copias amplificadas del blanco o la concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra. Se usa para medir la carga viral o bacteriana en diferentes tejidos. La segunda, se aplica cuando se desean evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos. 

Cualquiera que sea el tipo de cuantificación que se elija, el software del equipo, está capacitado para llevar a cabo los análisis matemáticos y estadísticos que se requieren en cada tipo de cuantificación.

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